HPLC在全行業(yè)運(yùn)用越來(lái)越廣泛，因此每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室分析人員都應(yīng)該熟練掌握并應(yīng)用HPLC，對(duì)于一些常見(jiàn)的故障分析應(yīng)該做到游刃有余，才能在運(yùn)行故障的時(shí)候即使解決問(wèn)題，提高工作效率。
本文主要介紹高效液相色譜儀HPLC30個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題的對(duì)策。
1、保留時(shí)間發(fā)生漂移或快速變化的原因
關(guān)于漂移問(wèn)題：
①溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定；
②流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等；
③柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡。
關(guān)于快速變化問(wèn)題：
①流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定；
②泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出；
③流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合。
2、出現(xiàn)拖尾或雙峰的原因
①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子；
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子；改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子；
③可能柱超載，減少進(jìn)樣量。
3、HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法
①樣品量不足，
解決辦法為增加樣品量；
②樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子；
③樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器；
④檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可；
⑤檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)；
⑥檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗；
⑦檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣；
⑧記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可；
⑨流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可；
⑩檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。
4、做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定
①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；
②比例閥失效，更換比例閥即可；
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可；
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；
⑥梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。
5、更換了另一種牌號(hào)ODS柱，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)？
這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過(guò)去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如，三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時(shí)間的重現(xiàn)。
6、HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高
柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶最常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。
①拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查；
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；
③將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過(guò)的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題，SGE提供的Rheodyne7315型，過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。
7、色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎
不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過(guò)這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)椋弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。
相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了�？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如，經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。
8、基線漂移原因、解決方法
1)原因分析
①柱溫波動(dòng)。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類(lèi)檢測(cè)器。）
②流動(dòng)相不均勻。（流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。）
③流通池被污染或有氣體
④檢測(cè)器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）
⑤流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化
⑥柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)
⑦流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成
⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰
樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。
⑨使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器。
⑩檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。
2)解決方法
①控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器
②使用HPLC級(jí)的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。
③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）
④取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè)器手冊(cè)更換流通池窗。
⑤更改配比或流速。為避免這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。
⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。
⑦檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。
⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動(dòng)相。
⑩將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)。
9、規(guī)則的基線噪音產(chǎn)生的原因
①在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣（尖銳峰）
②漏液。
③流動(dòng)相混合不完全。
④溫度影響（柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱）
⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備（偶然噪聲）
⑥泵振動(dòng)。
解決方法 ：
①流動(dòng)相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。
②檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。
③用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑
④減少差異或加上熱交換器
⑤斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。
⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。
本文針對(duì)HPLC使用常見(jiàn)故障進(jìn)行了較全面的分析，如，輸液泵中的單向閥、泵墊圈、色譜柱、檢測(cè)器的常見(jiàn)故障，并結(jié)合日常工作實(shí)際，提出了一些可參考的做法和解決對(duì)策。以便使用者能及時(shí)注意所述問(wèn)題，做到有問(wèn)題及時(shí)解決，這樣既能大大延長(zhǎng)儀器的使用壽命,又能使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。
10、不規(guī)則的基線噪音產(chǎn)生原因
①漏液。
②流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成。
③流動(dòng)相各溶劑不相溶。
④檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問(wèn)題。
⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡。
⑥檢測(cè)器內(nèi)有氣泡。
⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。）
⑧檢測(cè)器燈能量不足。
⑨色譜柱填料流失或阻塞。
⑩流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常。
以上相應(yīng)解決方法：
①檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。
②檢查流動(dòng)相的組成。
③選擇互溶的流動(dòng)相。
④斷開(kāi)檢測(cè)器和記錄儀的電源，檢查并更正。
⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)。
⑥清洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。
⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池。
⑧更換燈。
⑨更換色譜柱。
⑩維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置。
11、保留時(shí)間漂移的故障排除
保留時(shí)間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時(shí)間漂移和保留時(shí)間波動(dòng)。前者是指保留時(shí)間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時(shí)間無(wú)固定規(guī)律的波動(dòng)。將此兩種情況區(qū)分開(kāi)來(lái)對(duì)找到問(wèn)題的原因往往很有幫助。如，保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無(wú)規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)上，保留時(shí)間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過(guò)水解），色譜柱污染（由樣品或流動(dòng)相所致）等。
保留時(shí)間漂移的幾種最常見(jiàn)的原因如下：
1)色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡。通常平衡需要10-20個(gè)柱體積的流動(dòng)相，但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑（如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。 流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動(dòng)相成分。
2)固定相穩(wěn)定性
固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會(huì)慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動(dòng)相類(lèi)型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定；長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。 經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。
3)色譜柱污染
保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見(jiàn)原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過(guò)濾器，它可以過(guò)濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過(guò)實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來(lái)源。
樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。避免色譜柱污染最簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。
4)流動(dòng)相組成
流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見(jiàn)原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等。
5)疏水坍塌
當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤(rùn)固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動(dòng)相浸潤(rùn)固定相，再用高水含量的流動(dòng)相進(jìn)行平衡。色譜柱長(zhǎng)期儲(chǔ)存也會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如，Waters Symmetry Shield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如，Waters Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。
12、為何出現(xiàn)肩峰或分叉
①樣品體積過(guò)大－－用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；
②樣品溶劑過(guò)強(qiáng)－－采用較弱的樣品溶劑；
③柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件；
④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品；
⑤進(jìn)樣器損壞－－更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子。
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