一、概述
色譜分析中基線噪音大、規(guī)律性波動和漂移是比較常見的基線問題，這些異常的基線對方法的檢測靈敏度和雜質(zhì)組分的檢出能力具有很大影響，特別是在樣品純度測試以及痕量殘留物質(zhì)檢測中，異常的基線將會影響雜質(zhì)組分和痕量殘留物質(zhì)的定性和定量。
液相色譜中影響基線的因素很多，既會受到儀器硬件，如泵、混合器、燈能量和檢測器等影響，也會受到外界因素，如溫度、流動相組成和使用添加劑等因素的影響。
二、液相色譜儀常見基線問題
1、單向閥對壓力波動和基線的影響
采用液相色譜示差檢測器測定蜂蜜中糖含量的過程中偶爾會出現(xiàn)基線波動異常的情況，并且伴隨著泵節(jié)奏發(fā)生改變，檢查發(fā)現(xiàn)儀器壓力波動異常。
依據(jù)以往經(jīng)驗首先懷疑是流動相中有氣泡，于是停泵、對流動相進行超聲脫氣，然而重新開泵時發(fā)現(xiàn)儀器壓力一直很小并且不斷波動，運行一段時間后，泵自動停止運轉(zhuǎn)并發(fā)出警報“l(fā)ost prime”。
Purge管路中的氣泡，dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動相，此時發(fā)現(xiàn)沒有流動相流出，于是意識到問題所在。由于采用的是流動相在線混合的方式，其中一個通道走的是純乙腈，該儀器在用到純乙腈或高比例乙腈時單向閥經(jīng)常會出現(xiàn)問題，據(jù)說該故障是由于乙腈發(fā)生交聯(lián)黏住單向閥中的寶石球引起的。于是根據(jù)經(jīng)驗，對單向閥進行拆卸并超聲清洗。
拆卸單向閥時，由于重力作用流動相會不斷流出（平時使用時流動相放于儀器的上端），要阻止流動相的流動有兩種方法，
（1）直接將管路從流動相瓶中拿出來，但是也會有少量殘余的液體流出；
（2）關(guān)閉GPV（梯度比例閥）。關(guān)閉GPV之后就可以拆卸單向閥了，首先明確儀器有幾個單向閥，任何一個單向閥有問題都會引起壓力波動，因此最好同時進行清洗。
單向閥清洗流程：先將單向閥用5％左右硝酸溶液超聲15~30min，然后換用純水超聲15~30min，最后換用甲醇超聲15~30min，如果時間充裕，多超聲一會也無妨。
清洗、安裝好單向閥（安裝時兩個單向閥的箭頭均朝上）后再次在dry prime模式下用針筒抽取管路中的流動相，排除氣泡。排氣結(jié)束后重新啟動泵，儀器壓力逐漸變大，系統(tǒng)壓力波動恢復(fù)到允許的范圍內(nèi)，走基線和測定時基線波動有所改善。
2、參數(shù)設(shè)置對基線的影響
有些儀器能夠通過修改靈敏度或者增益等參數(shù)影響色譜圖的基線和信號響應(yīng)。有的液相色譜儀示差檢測器就有這樣的功能，其靈敏度有1~1024共11種選項，同樣以蜂蜜中糖含量測定為例，選擇低、中、高3種模式進行測定，考察靈敏度對基線噪音的影響。
對比不同靈敏度模式下測定的色譜圖、基線噪音和壓力波動可以發(fā)現(xiàn)，靈敏度對色譜峰的響應(yīng)值和基線噪音有很大的影響，靈敏度越大，色譜峰響應(yīng)值越高，同時基線噪音也越大。
當靈敏度由4變?yōu)?28時，果糖的響應(yīng)值也由60MV增加到2000MV，同時基線噪音由2MV左右增加到50MV左右。從壓力波動的圖中可以發(fā)現(xiàn)，靈敏度的改變對壓力波動幾乎沒有影響，不同靈敏度模式下壓力波動范圍均維持在20psi左右，可見壓力并不是此次噪音增大的主要因素。
3、流動相混合方式對基線的影響
通常液相色譜儀配置高壓二元泵或者低壓四元泵，而泵的沖程體積以及混合器（二元高壓泵）的體積大小均會對色譜基線噪音產(chǎn)生影響，泵的沖程體積越小以及混合器的體積越大，由輸液造成的脈沖相對越小，基線越平穩(wěn)。
示差檢測器是連續(xù)檢測樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測器，該檢測器對流動相的變化和溫度都很敏感，流動相通過比例閥進行在線混合可能導(dǎo)致流動相混合不均勻引起液體折光率產(chǎn)生微弱差異，同時乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化。
采用單泵預(yù)混的方式可以避免上述問題，因此使用示差檢測器時，如果流動相需要用混合溶劑，建議先將流動相進行預(yù)混，并采用單一流路的方式運行。實踐證明，采用流動相預(yù)混和單一流路的方式基本消除了測糖過程中的基線波動現(xiàn)象。
4、氘燈對基線的影響
氘燈是紫外檢測器中非常重要的光學(xué)部件，在生產(chǎn)初期就被廠家賦予了一定的生命值，其設(shè)計使用時間有500、1000，2000小時等等。當氘燈使用時間超過設(shè)計使用時間后就可能出現(xiàn)氘燈能量下降、基線漂移和噪音增大等現(xiàn)象。因此如果實驗中出現(xiàn)基線漂移和噪音增大的情況，有必要去檢查一下氘燈的使用時間和氘燈能量。
5、流通池污染對基線的影響
通過一系列的排查，排除掉單向閥、色譜柱、流動相和氘燈等因素，最后檢查流通池。首先實驗室要有兩臺相同型號的檢測器，在確保另外一臺設(shè)備完好的情況下將流通池進行調(diào)換，調(diào)換后發(fā)現(xiàn)，原先有故障的設(shè)備恢復(fù)了正常，相反，原來正常的設(shè)備基線噪音變大，從而表明流通池出了問題。對流通池進行清洗，清洗之后基線恢復(fù)了正常（操作指南上有流通池的清洗步驟）。
6、流動相對基線的影響
高效液相色譜儀在測定之前通常需要對流動相進行切換，尤其用到緩沖鹽時需要用高比例的水相先進行過渡，然后再用流動相平衡色譜柱，如果測定時操之過急，色譜柱未完全平衡就進行測定容易出現(xiàn)基線不同程度的漂移。
流動相對基線噪音的影響因素很多，例如氣泡、污染物、添加劑、緩沖鹽等，都可能導(dǎo)致基線噪音增大或者基線的漂移。
7、反壓（又叫背壓）對基線的影響
高效液相色譜儀的系統(tǒng)壓力較高，色譜柱是產(chǎn)生系統(tǒng)壓力的主要部件，流動相流過色譜柱和檢測器之后壓力迅速下降會使流通池中產(chǎn)生氣泡，從而影響基線。反壓抑制器能夠減緩流動相流出流通池時的壓力下降程度，防止流通池中產(chǎn)生氣泡。有些儀器是在檢測器后面加上一段比較細的管路，還有些儀器是在檢測器后面加上一個反壓抑制器，通過較細的管路或者反壓抑制器對檢測器形成一定的反壓。不合適的反壓也會對儀器或者基線產(chǎn)生一定的影響，反壓太高超過流通池的耐受壓力，會導(dǎo)致流通池的損壞；反壓不夠流通池中容易產(chǎn)生氣泡，影響基線。
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