1 目的
測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量。
2 實驗部分
按照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行樣品前處理和儀器分析。
2.1儀器及試劑
高效液相色譜儀、2414示差折光檢測器；果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖均為分析純；乙腈，色譜純；實驗用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得，18MΩ•cm，25 ℃
2.2儀器分析條件
—參照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定
色譜柱：CNW Athena NH2(250mm×4.6mm, 5μm)；流動相：乙腈：水=85：15；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；色譜柱溫度：40℃；檢測器溫度：40℃
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖用水溶解并定容至100mL，配成濃度為5g/100mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
由于是條件摸索階段，因此不急于配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，先配制一個較高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1g/100mL）用于確定儀器分析條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
3 遇到的問題與分析
3.1 儀器分析條件的優(yōu)化及單標(biāo)確認(rèn)
按照上述儀器分析方法對濃度為1g/100mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖1。
圖1 糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（乙腈：水=85：15）
從圖中可以看出，雖然4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中對應(yīng)出現(xiàn)4個色譜峰，但是卻存在以下幾個問題：
（1）該色譜條件下4種組分的分離時間較長，4種組分完全分離需要近35min，各組分之間的分離度較大，可以嘗試進(jìn)行條件優(yōu)化，縮短檢測時間；
（2）相同濃度下4種組分的出峰響應(yīng)值相差較大，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時可以依據(jù)樣品中的含量適當(dāng)降低組分1或者增加其它組分的濃度；
（3）基線噪音較大，不利于微量組分的分析，對樣品的定性和定量都會產(chǎn)生影響。
針對上述問題，決定先嘗試優(yōu)化儀器分析條件，縮短樣品測試時間。
混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在色譜柱和儀器的耐受范圍內(nèi)，由于是條件摸索階段，因此暫時先不調(diào)整，仍然采用該濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。
分析條件中采用的是示差檢測器，該檢測器不允許進(jìn)行梯度洗脫，要改善分離條件縮短測試時間只能從流動相上做文章，于是嘗試通過改變流動相比例進(jìn)行優(yōu)化。氨基色譜柱既可以用于正相模式反相模式，又可以用于反相模式，在正相模式下，可以代替硅膠柱使用；在反相模式下可用于碳水化合物的分析，尤其適用于糖類分析，本實驗即是采用氨基色譜柱的反相模式進(jìn)行糖類分析。
實驗中發(fā)現(xiàn)微調(diào)流動相中有機(jī)相的含量，各組分間的分離度有很大的變化。增加乙腈的比例能夠提高各組分間的分離度，但測試時間延長；降低乙腈的比例會降低各組分的分離度，但卻很大程度上縮短了測試時間。當(dāng)流動相為乙腈：水=75：25時，4種糖的測定時間縮短至15 min，同時4種糖具有較好的分離度。
圖2 糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（乙腈：水=75：25）
上述測試過程中使用的是4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個峰對應(yīng)的待測組分還是未知的，因此在該儀器分析條件下先對各組分進(jìn)行單標(biāo)確認(rèn)。
圖3 單標(biāo)確認(rèn)色譜圖
在單標(biāo)確認(rèn)的過程中又發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：
（1）雖然混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個完全分離的色譜峰，但是對比單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn)，每個單標(biāo)色譜圖中都出現(xiàn)了兩個峰，而4min附近色譜峰的峰面積和峰高幾乎一致，很有可能是溶劑峰；
（2）如果4min附近的色譜峰是溶劑峰，那么4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中實際上只分離出了3種組分，有一種組分沒有出峰或者與其他組分的保留時間接近；
（3）對比葡萄糖和麥芽糖的單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn)，兩者的保留時間完全一致，可能是操作有誤，兩者組分在配制或在進(jìn)樣時弄錯了。
針對上述問題逐一進(jìn)行排查，由于所用的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液是用水配制和稀釋的，4min附近的色譜峰是否是溶劑峰只需進(jìn)一針?biāo)畼蛹纯�，因此首先以純水為樣品進(jìn)行進(jìn)樣測試，并且重新配制葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液并測試，配制和進(jìn)樣過程及其仔細(xì)防止中間環(huán)節(jié)出錯。
實驗結(jié)果表明：4min附近的色譜峰為溶劑峰（見圖4），同時重新測定后葡萄糖和麥芽糖的保留時間仍然完全一致。
圖4 水測試色譜圖
葡萄糖和麥芽糖的保留時間一致，考慮是否是儀器分析方法不合適導(dǎo)致這兩種組份沒有分離？在前面的實驗中發(fā)現(xiàn)，微調(diào)流動相比例4種糖的保留時間會有很明顯的變化，于是嘗試通過改變流動相的方式進(jìn)行分離，然而實驗中發(fā)現(xiàn)改變流動相兩者的保留時間是同步變化的。
難道是色譜柱的原因？色譜柱柱效下降導(dǎo)致兩者不能分離？于是更換新的色譜柱再次分離，結(jié)果還是沒有能夠?qū)烧叻蛛x。如果葡萄糖和麥芽糖無法分離，實驗便無法進(jìn)行下去，在經(jīng)過上述嘗試之后將問題的矛頭指向了所用的試劑。查試劑臺賬，發(fā)現(xiàn)實驗室里還有其他品牌分析純的葡萄糖，而麥芽糖僅此一瓶，但是幸運的是發(fā)現(xiàn)了葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品，決定使用麥芽糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品試一下。
圖5 不同麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
實驗結(jié)果表明：采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間保持一致，而采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間出現(xiàn)了差異。
重新配制4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述儀器分析條件進(jìn)行測定時4種糖得到了較好的分離，因此繼續(xù)延用上述的儀器分析條件進(jìn)行后續(xù)測定。
3.2 溶劑效應(yīng)的消除
4種糖的分離和確認(rèn)過程基本完成，接下來解決溶劑效應(yīng)的問題。溶劑效應(yīng)在液相分析中是一種很常見有時也是很讓人頭疼的現(xiàn)象，嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)可能會影響到分析結(jié)果。溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的原因和處理方法論壇中早有前輩進(jìn)行過細(xì)致的講解，這里也不過多的贅述。
雖然此次的溶劑效應(yīng)不會影響定性和定量，但是那“高高再上”的溶劑峰看著很難受，于是想嘗試解決或者減輕溶劑效應(yīng)，降低溶劑峰的峰響應(yīng)。
為了減少分析時間，同時減少標(biāo)準(zhǔn)品的消耗（麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品只有0.25g/瓶）決定直接用流動相中的兩相（乙腈和水）進(jìn)行嘗試。通過改變乙腈和水的體積比考察溶劑峰的出峰情況。
實驗發(fā)現(xiàn)，在上述色譜條件下以乙腈為樣品進(jìn)行測試時溶劑峰為響應(yīng)值很大的倒峰；以水為樣品進(jìn)行測試時溶劑峰為響應(yīng)值很大的正峰；調(diào)節(jié)兩者的比例可以改變?nèi)軇┓宓某龇迩闆r，如圖6。
圖6 乙腈水比例對溶劑峰的影響
從圖中可以看出，試樣為70%乙腈和80%乙腈時溶劑峰已經(jīng)變小許多，而以流動相為樣品(75%乙腈)時溶劑效應(yīng)得到了進(jìn)一步的降低，也就是人們常說的，可以嘗試用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或者定容樣品減輕溶劑效應(yīng)。
于是決定采用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，然而在配制過程中又遇到了難題，高濃度糖的水溶液與乙腈不能互溶，兩者會出現(xiàn)明顯的分層。適當(dāng)提高水相的比例，當(dāng)采用50%乙腈水溶液時，兩相沒有出現(xiàn)分層，同時測定時有效地降低了溶劑效應(yīng)，因此在后續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品前處理過程中均采用50%乙腈水溶液。
3.3 基線噪音的消除
優(yōu)化完儀器分析條件并解決了溶劑效應(yīng)問題之后，接下來就要解決基線噪音的問題了。
液相中產(chǎn)生基線噪音的原因有：
(1) 燈能量下降；
（2）流通池污染；
（3）泵壓不穩(wěn)；
（4）氣泡等。
依據(jù)消除基線噪音的方法分別對單向閥、色譜柱、樣品池和參比池等進(jìn)行維護(hù)，然后再對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，結(jié)果都沒有能夠得到理想的色譜圖，基線噪音依舊很大�？紤]到前期測定時流動相微調(diào)會對樣品出峰有很大影響，同時依據(jù)示差檢測器的檢測原理（示差檢測器是連續(xù)檢測樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測器），該檢測器對流動相的變化和溫度都很敏感，而實驗中流動相都是通過比例閥在線混合的方式進(jìn)行的，在線混合不僅可能導(dǎo)致流動相組成會有微弱的差異，同時乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化，因此嘗試采用流動相預(yù)先混合的方式，即按照在線混合優(yōu)化后的比例進(jìn)行預(yù)先配制流動相然后進(jìn)行測試，采用該方法后基線噪音得到明顯改善。
注：流動相在線混合的方式雖然會引起基線噪音，但是在前期方法摸索階段，對流動相進(jìn)行優(yōu)化時還是方便可行的，可以通過此方法摸索出合適的流動相比例后再采用預(yù)混的方法進(jìn)行測定。
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